氧化應激與抗氧化治療－台灣氫水實驗室

一、自由基生物學研究的歷史

自由基是含有未成對電子的原子、原子團或分子。自由基是維持正常生命所必需的物質，自由基反應是能量代謝的基礎，部分自由基是細胞內重要信號分子，自由基也是生物大分子、細胞的危險殺手 [23]。生理情況下，體內自由基不斷產生，也不斷被清除，使之維持在一個正常生理水平上，自由基過多或過少均會給機體造成不利影響甚至傷害。生物體內自由基類型有很多，例如半醌類、氧、碳和氮自由基等，其中研究比較多的是氧自由基和氮自由基。氧自由基包括超氧陰離子、單線態氧和羥自由基，因過氧化氫等在生物學作用上與氧自由基類似，常把氧自由基和過氧化氫等共稱為活性氧。

從自由基被發現到進入醫學生物領域，先後經歷了幾個重要階段。 1775年，英國化學家發現了氧氣，人們知道氧氣是人體所必需的物質，後來人們逐漸認識到氧氣的毒性作用，但沒有認識到自由基存在。 1900年以前，人們對自由基的認識很局限，認為是化學反應過程可能存在的一類活性分子，但也只是停留在理論推測上。 1900年 Gomberg 成功製備出可以獨立存在的自由基三苯甲基，才真正認識到自由基是可以獨立存在的物質。但這個階段人們並沒有把自由基與生物學聯繫起來。

上個世紀五六十年代，輻射生物學的研究，證明自由基可導致機體損傷，才啟動了自由基生物學。但此時仍沒有意識到機體內存在自由基。 1969年，美國學者 McKord 和 Fridovich 發現了SOD ，才使人們認識到自由基是機體的組成成分。 1973年， Babior 等證明了炎症反應與自由基的關係。 1981年， Granger 等證明了缺血再灌注損傷與自由基的關係，才引起了自由基生物學的研究高峰。這時，人們普遍認為，自由基是造成組織細胞損傷的元兇，能清除自由基的物質可以治療各類自由基引起的損傷。一直到現在，仍有一些人堅持這樣的錯誤觀點。

隨著研究的深入，人們逐漸認識到，自由基不僅可引起機體損傷，也是生物活性物質，具有重要的生理作用。其中最重要的一個發現，就是確定了一氧化氮是一種信號分子。近年來，又先後證明，過氧化氫，甚至超氧陰離子等常見活性氧都具有信號調節作用。

二、氧化應激與抗氧化的思路

最近幾年，關於自由基或活性氧有幾個比較重要的進展值得關注。一個是內源性抗氧化，另一個是抑制活性氧的產生，最後是選擇性抗氧化。

氧化應激損傷是許多疾病發生的基礎，但也會同時啟動機體產生內源性保護反應，產生何種結果關鍵是氧化應激的程度，嚴重的氧化應激可產生損傷，但適度的氧化應激可動員機體產生保護作用 (Apel K,et al.2004) 。

關於氧化應激啟動內源性保護反應的研究很多，其中研究比較深入的是抗氧化反應元件。 NF-E2-related factor （ Nrfs ）是啟動抗氧化反應元件的轉錄因子，屬於抗氧化反應元件 CNC(cap 'n ' collar) 轉錄因子家族，其主要成員有 Nrfs 和 Bachl-2 。 CNC 轉錄因子需要與其它同類蛋白結合形成異二聚物後，才能反式作用於抗氧化反應元件 (ARE) 介導靶基因的表達，小 Maf 蛋白能與 CNC 轉錄因子形成異二聚物，而且這些複合物在抗氧化劑誘導的氧化應激反應中，能改變 ARE介導的靶基因表達。 ARE 介導的靶基因主要包括 II 相酶，如穀胱甘肽硫轉酶（ GST ）、血紅素加氧酶（ HO-1 ）和醌還原酶（ NQO1 ）等。這些酶大部分是機體抗氧化能力的重要組成部分(Clark J, et al. 2008) 。

Nrfs 有 Nrf1 、 Nrt2 和 Nrf3 三種亞型。 Nrfl 、 Nrt2 都參與氧化應激反應，促進 ARE 介導的抗氧化基因轉錄，但 Nrf3 的功能還不是很清楚，其中對 Nrt2 的研究最多。在靜息細胞中，絕大部分 Nrf2 在細胞質中以非活性狀態和 Keapl 相結合， Nrt2 的 Neh2 結構域是其結合部位，另一部分以活性狀態存在於細胞核中介導基因的基本轉錄。 Keapl 可抑制 Nrf2 活性並介導 Nrt2 降解。 Keapl 從 Keapl-Nrf2 複合物中解離後，活性狀態的 Nrf2 增加，核轉位後啟動轉錄活性(Kobayashi M et al. 2002) 。當暴露於氧化應激或親電子物質時，通過細胞外信號通道途徑蛋白激酶 C(Protein kinase C ， PKC) 、磷脂酰肌醇 -3 激酶 (PI3K) 和 ( 或 ) 絲裂原活化蛋白激酶 ( MAPK) 途徑，致使 Nrt2 磷酸化而調節 ARE 活性， Nrt2 從 Keapl-Nrf2 的複合物中解離是 Nrf2核轉位並在核內積聚的基礎。也有研究認為，真核起始因子 2 (Eukaryotic initiation factor 2 alpha， elF2) 激酶家族成員中的 PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase) 能夠直接作用於 Nrt2而使其磷酸化， PERK 依賴的磷酸化發生在 Nrt2 的 Neh2 結構域，導致構象改變而觸發了 Keapl-Nrt2 複合物的解離，並阻止它們重新形成複合物，並認為 PERK 途徑 PERK 活化後觸發的 UPR 是胞漿中 Keapl-Nrt2 解離和繼後 Nrt2 核轉位的必需和充分條件 (Rushworth SA et al. 2006; Kweon MH et al. 2006) 。除內源性氧化應激外，研究還發現，許多天然和合成物質具有激活 Nrf2 的作用，其中萊菔硫烷 (sulforaphane ， SFN) 是目前發現作用最強的物質 (Fahey JW et al. 2002) 。

眾所周知，體內活性氧的產生一般都來自氧化還原反應，如果能抑制氧化還原反應，就能減少活性氧的產生，能發揮這樣作用的物質有一氧化碳和硫化氫，當然這些物質的毒性都很強，目前尚難以直接應用與臨床，將來也許能通過研究這些物質，開發出毒性弱的替代藥物。

選擇性抗氧化的研究是基於這樣的事實，在各種活性氧中，過氧化氫和一氧化氮等具有非常重要的信號作用，毒性作用很弱，而羥自由基和過氧亞硝基陰離子毒性強，是導致細胞氧化損傷的主要介質 [24， 25]。過去人們針對氧化應激損傷治療的研究思路是尋找足夠強的還原性物質，但還原性太強，必然導致內源性氧化還原狀態的失衡，甚至是導致抗氧化治療無效的關鍵原因。因此，尋找可選擇性中和羥自由基和過氧亞硝基陰離子的物質，是治療各類氧化損傷的有效方法，是抗氧化應該選擇的正確思路之一。特異性抗氧化是用比較特異的抗氧化物質來阻斷那些主要損害機體的自由基，保留正常或好的自由基的方法，日本學者發現的一個藥物：衣達拉奉，就是一個典型代表。 最近有研究發現，氫氣也是具有選擇性抗氧化的物質之一，這也是將來研究的重要方向。

三、抗氧化的研究設想

上述三種抗氧化思路各有優缺點，內源性抗氧化的途徑，是啟動內源性抗氧化能力，應該是比較理想的思路，但由於需要經過基因表達，對那些急性氧化損傷很難起到明顯效果。抑制活性氧產生也比較有效，但抑制氧化還原反應，必然干擾正常集體的生物學過程，產生的毒副作用會比較大。選擇性抗氧化比較理想，但難以用與維持性治療。那麼，是否可以將這些方法結合起來，取長補短。最近，已經有人嘗試將後兩種方法聯合治療心臟移植的體外心臟保護，取得了比較可喜的效果，相信這將是將來抗氧化治療的一個理想手段。

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