氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧－台灣氫水實驗室

該文首次採用注射含氫水的方法治療腦損傷，是對去年日本Nature Med文章的改進和提高。原來的研究是採用呼吸一定濃度的氫氣,達到治療腦缺血再灌注損傷的目的，但是，通過呼吸的方法不僅在給藥過程中存在爆炸的危險，而且需要比較特殊的設備，操作比較複雜，在臨床上難以推廣，因此，尋找更加實用的給藥方法也是需要探討的問題。經過理論推算，如果將純氫氣在生理鹽水中溶解，經過一定的處理，使其達到飽和溶解，可製造出氫氣的生理鹽水飽和溶液，這樣就可通過注射方法給藥。 Neuroprotective Effects of Hydrogen Saline in Neonatal Hypoxia-ischemia Rat Model [/color]Abstract Cerebral hypoxia–ischemia (HI) represents a major cause of brain damage in the term newborn. This study aimed to examine the short and long-term neuroprotective effect of hydrogen saline (H2 saline) using an established neonatal HI rat pup model. Seven-day-old rat pups were subjected to left common carotid artery ligation and then 90 min hypoxia (8% oxygen at 37 ?C). H2 saturated saline was administered by peritoneal injection (5 ml/kg) immediately and again at 8 h after HI insult. At 24 h after HI, the pups were decapitated and brain morphological injury was assessed by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), Nissl, and TUNEL staining. Acute cell death, inflammation and oxidative stress were evaluated at 24 h by studying caspase-3 activity, MDA measurement as well as Iba-1 immunochemistry in the brain. At 5 weeks after HI, spontaneous activity test and Morris water maze test were conducted. We observed that H2 saline treatment reduced the caspase activity, MDA, Iba-1 levels, the infarct ratio, and improved the long-term neurological and neurobehavioral functions. H2 saline has potentials in the clinical treatment of HI and other ischemia-related 本文實現了這一目的. 中文摘要:

cerebral diseases.[color=red]

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1引言新生兒腦損傷最重要的原因是腦缺血缺氧，雖然其機制不是很清楚，但是神經元細胞死亡或調亡可能在其中扮演重要的作用.值得一提的是在受到損傷的最初幾天內腦中半暗帶發生的凋亡是可以作為治療的靶點的，可是現在還沒有治療腦缺血缺氧病人的特異性手段。在缺血性腦損傷包括新生兒缺血缺氧事件中炎症和氧化應激是凋亡的主要原因，有報導小神經膠質細胞參與了腦缺血缺氧誘導的炎症過程。小膠質細胞中的同種異體移植炎性因子-1是其活性升高的一個指標。缺血缺氧後的氧化應激導致DNA、細胞膜和蛋白的損傷，最終導致細胞凋亡，丙二醛是脂質胞膜氧化後的產物也是氧化損傷的標誌。有報導氫氣在心、腦和肝缺血再灌注損傷後有保護作用，氫氣可以中和自由基減少氧化應激，可是臨床應用氫氣還要考慮其安全性和方便性，本研究中，我們給予新生缺血缺氧的動物模型腹膜內註射飽和的氫氣鹽溶液，考察其神經保護作用。 2結果 2.1尼氏染色法我們用尼染檢測了氫氣鹽溶液的三個劑量組來找到其中的有效劑量，圖1顯示的是缺血缺氧24小時後的小狗腦皮層和海馬的尼染結果圖，發現在皮層和海馬的CA1區域有大量的深色緻密的神經元，而且H2W組的陽性細胞要多於模型組，我們用5ml/kg劑量組用於以下的研究，因為它的效果要好於其它劑量組。 2.2 TTC染色圖2顯示了出生8天的大鼠在缺血缺氧24小時後的TTC染色結果圖，發現模型組梗死區比例(10.8%)明顯高於H2W組(0.99%)，後者與正常對照組相當。 2.3丙二醛含量檢測缺血缺氧24小時後的丙二醛含量，發現模型組明顯高於對照組，而給予氫氣鹽溶液後可以降低缺血缺氧造成的MDA含量升高。 2.4 TUNEL染色圖3是不同組的TUNEL染色放大效果圖，從放大的圖看，海馬和皮層的細胞核可見被染色，結果顯示模型組有明顯增加的陽性染色，而給予氫氣鹽溶液後可明顯可降低核染，在正常小狗的組織樣本內也能見到一些核染的細胞。 2.5細胞凋亡蛋白酶-3的活性測定圖5顯示了caspase-3活性測定結果，模型組皮層caspase-3的活性為1.18±0.23，而海馬為0.93±0.22。在給予氫氣鹽溶液後可見其活性的明顯下降，結果分別為0.12±0.09和0.09±0.10，這與TUNEL染色結果相同。 2.6免疫組化分析圖4顯示Iba1陽性細胞有小的核、固縮的胞質和細的分支突起，這種細胞在白質和灰質等實質中都有發現，它們的特徵外形和廣泛分佈與經典的分支小膠質細胞都高度一致。氫氣鹽水處理可明顯減低缺血缺氧24小時後的樣品陽性細胞的數目。 2.7體重不同組別在處理15天后沒有體重上的差異，在20天后卻發現模型組和給藥組體重上的差異，而對照組和給藥組沒有區別。 2.8功能測試本位反射實驗印證了模型組大鼠的感覺運動功能受到影響，0分代表正常功能而1分和2分代表感覺運動功能的缺失。所有的對照組得分為0，而22.22%的模型組得分為0，77.78%為1，66.67%為2；63.64%給藥組得分為0，36.36%得分為1，9.09%為2。卡方檢驗組之間有顯著的差異。 2.9自主活動測試為了顯示行為學上的時間依賴性，圖6顯示了自發運動的軌跡和統計結果。結果提示所有的組大鼠在測試箱中隨著時間的增加活動呈減少態勢。可是給藥組比模型組更活躍，移動次數也增多，而且與正常組無區別，給藥組平均總距離也比模型組少。 2.10 Morris水迷宮測定缺血缺氧24小時後大鼠的避水潛伏期，發現到達平台的時間對照組為12±1.23秒，而模型組為27±3.21秒，給予氫氣鹽水後時間大大縮短(15 ±1.89秒)，而且給藥組與對照組無區別，提示氫氣鹽水提高了缺血缺氧造成的認知與學習能力的下降趨勢。 3討論我們考察了新生大鼠腹膜給予飽和氫氣鹽溶液的神經保護作用，短期作用提示了其明顯減少梗死面積，增加活的神經元數目，減少凋亡細胞數量，抑制caspase-3活性，阻止小膠質細胞激活，減少氧化應激水平，這些短期的作用在缺血缺氧5週後可以轉為神經保護的長期作用，提示了氫氣鹽溶液治療新生兒腦功能障礙的一個潛在治療手段。氫氣的神經保護作用是中和自由基，尤其是羥基自由基和過亞硝酸鹽。羥自由基是氫氧離子的中性形式，同時也是細胞代謝的正常產物，它呈高還原性，在體內很短的半衰期（9-10秒）使其成為非常危險的基團。除此之外，細胞急劇氧化中產生了超氧負離子和一氧化氮，它們可以引起炎症反應，在正常情況下，它們一起反應並產生大量的活性氧分子—過氧亞硝酸鹽陰離子是潛在的氧化試劑，可引起DNA片段化與脂質氧化，同時它在體液中與二氧化碳反應形成反應中間體，後者可氧化巰基和硝酸酚類化合物，如酪氨酸。在新生兒缺血缺氧腦損傷後，活性氧與活性氮，如•OH, O2-, hydrogen dioxide (H2O2), NO, ONOO–在細胞死亡中扮演重要的作用，這其中•OH和ONOO–更是強的還原性並不加區分地與核酸、脂質和蛋白反應。腦有潛在的防禦體系，包括飲食中的自由基清除基（維生素C和維生素E），內源性穀胱甘肽和抗活性氧自由基酶。可是，還沒有發現針對•OH和ONOO–的解毒系統。近來，Ohsawa等發現了氫氣分子可選擇性減少自由細胞體系中的•OH and ONOO–，因此在大鼠的中腦動脈閉塞模型中產生抗氧化活性的治療作用。氫氣的這一能力可能是本實驗中其神經保護作用的機制。近來研究報告顯示氫氣作為抗氧劑可以在腦與肝臟的缺血性損傷中通過選擇性清除•OH and ONOO–發揮保護作用，最近一篇文獻也提示了吸入氫氣減少了心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型中的梗死區面積，給予腹膜注射氫氣鹽溶液可以防止應激造成的身體活動受限從而導致學習記憶下降。雖然2%氫氣的含量在臨床上是安全的，可是實施起來並不方便，因為這需要房間或者面罩，因此，用氫氣鹽溶液迅速注射就不用考慮安全性的問題了。我們選擇性研究了腦損傷的兩個機制：炎症和氧化應激。小膠質細胞激活可以引起炎症反應，因為在中樞神經系統內存在免疫細胞，它們對中樞性損傷如新生兒缺血缺氧起到正常的免疫應答作用並通過吞噬作用去除受損細胞。 Iba1是一個147個氨基酸的鈣結合蛋白，被普遍看作小膠質細胞的標誌，其基因和蛋白都與AIF-1類似，後者參與各種炎症反應，如有報導其在神經性炎症紊亂和腦缺血損傷引起的小膠質細胞激活中起重要作用，其表達上調見於神經元細胞凋亡和中樞運動性神經元和感覺的受損退化。本研究中，氫氣鹽溶液減少腦損傷可能是通過抑制缺血缺氧造成的炎症性反應，除此之外，它也能通過減少AIF-1的表達而降低凋亡的發生，我們在另一組實驗中利用氫氣也得到相似的結果。氧化應激可能導致炎症的發生或者提高炎症反應，氫氣鹽溶液通過減輕新生兒腦中缺血缺氧造成的氧化應激就可以減少炎症和凋亡的發生。即使氫氣鹽溶液和氫氣本身的藥代動力學有什麼不同還不清楚並值得進一步研究，鹽溶液優於氫氣的特點就是安全性、給藥的方便性和更高的溶解度，已證實高於4 %的氫氣濃度可導致炎症與危險，應用氫氣還需要密封的房間或者面罩，以前的研究有用氫氣水溶液灌胃給藥的。即使口服給藥是安全的但是水中的氫氣容易蒸發並在胃中和小腸中損失，就很難控制濃度和吸收了，因此，我們利用腹膜注射給藥就能達到迅速抽取藥液迅速注射，從而避免氫氣逸到周圍了，氫氣鹽溶液的另一個比氫氣和水溶液優勢的就是可以達到更高的給藥濃度和準確度本研究的特點就是評價了神經生物學和行為學上的長期作用，我們發現氫氣鹽溶液不僅能阻止或者減少早期的病理性改變諸如梗死，或者生化改變諸如炎症和氧化應激，也能產生長期的功能恢復作用。該結果提示了其在新生兒缺血缺氧或其他腦損傷臨床上的應用前景。總之，腹膜給予氫氣鹽溶液可以通過減輕炎症和氧化應激減少新生兒缺血缺氧所造成的腦損傷，從而減少細胞凋亡的發生，提高長期的神經生物學和行為學功能。

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